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细胞融合技术的应用研究进展
日期：2024-05-17 15:48
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摘要：
人们很早就注意到了在自然条件下发生的细胞融合现象，首先在病料组织中发现了由细胞融合产生的多核细胞，紧接着发现在脊椎动物和无脊椎动物的正常细胞中也可发生细胞融合，随后在体外组织培养中也发现了离体细胞的融合现象。自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后，人们又实现了利用灭活病毒促进动物异种细胞融合，从而打破了细胞融合的种属屏障，推动细胞融合技术跃上新的
台阶。原生质体的大量制备较为困难，限制了植物细胞融合技术的发展，因此植物细胞融合的起步较动物细胞融合要迟10年左右。直到用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功后，才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因，人们又找到了比病毒简便、快速和高效且比病毒更易制备和控制，活性稳定，使用方便的化学物质PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合，但在PEG诱导细胞融合的有效的浓度范围内(50～55)对细胞毒性很大，因此人们又找到了新的方法来替代PEG，这些新方法有电脉冲诱导细胞融合技术和激光融合技术以及空间融合技术等。纵观细胞融合技术的发展历史，该技术的不断改进首先表现在融合剂上，从致癌活病毒到灭活病毒再到化学物质，其次体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法一般采用将化学法和物理法结合起来进行，如将磁、超声、机械等和激光、电相结合，同时添加化学剂以便进一步提高融合率，细胞融合的方法和手段始终朝操作方便、简单，便于量化研究，同时融合率又能得到不断提高的
方向发展。
1． 细胞融合的意义
所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下，两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合或细胞杂交口]。如取材为体细胞则称体细胞杂交，体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。细胞融合不受种属的局限，可实现种间生物体细胞的融合，使远缘杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限和生殖壁垒，极大地扩大了遗传物质的重组范围；细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，在技术和仪器设备上的要求不象基因工程那样复杂，投资少，有利于广泛开展研究和推广，有着重大的实践意义，正得到科学界的日益重视[2_引。经过长期反复研究和实践，细胞融合技术逐步发展和完善起来，已成为生物工程的基础技术之一。特别是近20年来，从理论和实践两个方面，有力地推动了生物科学各领域的发展。细胞融合方法得到了不断的更新，融合率也得到逐步的提高。
2． 动物细胞融合技术
动物细胞融合是从细胞水平来改变动物细胞的遗传性，用于生产单克隆抗体、疫苗等特定的生物制品，改良培育动物新品种，缩短动物的育种过程。动物细胞融合的应用范围已广及生物学的各个分支学科，特别是在绘制人类基因图谱方面取得了显著成绩。虽然细胞杂交属于理论生物学范畴，但在实际应用方面也有重大突破。在基础理论研究上，动物细胞融合技术对研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制等方面都有重要意义。在实际应用方面，动物细胞融合技术在**定向释放系统、细胞**以及抗肿瘤**等方面起到重要的用。动物体细胞杂交技术主要应用于以下几个方面。
2．1 用于基因定位和绘制人类基因图谱
杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与否与细胞的某一性状表达与否相联系，从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上。1967年Weise和Green发现在人和鼠的融合细胞中，人的染色体优先丢失，并证明利用这一特点有可能对人染色体上的
基因进行定位。1970年Ruddle等开始系统地用融合细胞作为实验系统来绘制人类基因图。
2．2 用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗
一般认为肿瘤细胞表面抗原不能诱导强的**应答反应，树突状细胞(dendriticcells，DCs)与肿瘤细胞融合形成的树突状细胞疫苗能够有效地激发机体的细胞**应答，无论是在动物研究还是在人体早期临床试验中都证明这是一种方便、**、可行的方法[4]。并且由于融合细胞可以在体内存活，因此可以维持较长时期的**应答，有利于诱发机体产生有效的抗肿瘤**。肿瘤抗原可以肽段或完整蛋白的形式与DCs结合，或者将肿瘤抗原基因转化进DCs中，使其内源性地表达抗原，这两种方法在抗肿瘤**应答中均有效-9]，但适于**的肿瘤抗原及其基因难以鉴定从而限制了其应用]，有实验证明用这两种方法制备的肿瘤疫苗的**原性不及肿瘤细胞与树突状细胞直接融合的异核细胞，融合细胞保持了DCs和肿瘤细胞的特性，并且能高效地将未知的肿瘤抗原提呈给**系统，今后肿瘤疫苗的研
究工作将集中在疫苗的纯化上，以期用高度纯化的杂合细胞来激发更为有效和强烈的**应答反应，使得这种方法在临床应用中更为实际.
2．3 用于生产单克隆抗体
使小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成能产生单克隆抗体(monoclonalantibody，McAb)的杂交瘤细胞，单克隆抗体具有专一性和灵敏性，作为理论研究的工具在病原检测和****以及食品**领域具有广阔的应用前景。1985年，中科院上海细胞生物学研究所研制成功抗北京鸭红细胞和**细胞表面抗原的单克隆抗体，同时还与有关医学部门合作，成功地制备了抗人肝癌和肺癌的单克隆抗体。在神舟**上我国自制的细胞电融合仪分别进行了植物细胞的电融合试验和动物细胞的电融合试验，动物细胞电融合实验采用纯化的乙肝疫苗病毒表面抗原**的小鼠B**细胞和骨髓瘤细胞，目的是获得乙肝单克隆抗体。目前有关单位利用McAb作用的专一性这一特点正在探索用“生物导弹”对癌症进行早期诊断和**。
2．4 用于动物育种
体细胞核移植技术(somatic cell nucleartransfertechnique，SCNT)是将细胞核移植到另一细胞的细胞质中的生物技术。动物体细胞融合后，杂种细胞难以发育再生为一个个体，但借助于细胞核移植的方法将融合后杂种细胞的细胞核移入去核成熟卵内，可培育新的杂种。另外，细胞核移植技术的建立，还为目前进行的哺乳动物体细胞克隆和转基因技术打下良好的实验基础[1]。
2．5 用于细胞疗法
SCNT将患者的任何体细胞与去核卵细胞融合，融合子进行有丝分裂形成囊胚，囊胚的内细胞团是多能干细胞，对多能干细胞进行诱导使其定向分化可形成所需的组织和器官用于器官移植，不仅解决了器官和组织来源问题，并且也避免了宿主对外来物的**排斥。
2．6 动物体细胞融合在基础理论研究方面的应用
(1)用于研究细胞的核质关系和个体发育。
2o世纪7O年代初，诞生了细胞拆合工程。Carter于1967年发现细胞松弛素B(CB)能诱发体外培养的小鼠L细胞的排核作用。Prescott等1972年首先应用离心术结合CB分离哺乳类细胞的胞质体获得成功，为研究哺乳类细胞的核、质相互关系、细胞质基因的转移开创了新的途径C1zJ。异核体和细胞杂合子被用来确定基因调节因子，这些调节因子决定一个细胞表型消失或得以保持以及赋予受体新性状；通过对供体和受体细胞所有细胞特异性基因表达研究，细胞融合有助于人们了解发育，特别是在研
究基因编码的可逆性方面。在个体发育过程中，血红蛋白存在着从胚胎型向胎儿型(幼虫)*终向**型的转换，对这些转换进行研究，除了揭示基因顺序表达的调控机理外，在医学方面也有意义，人们可以部分或全部扭转从胚胎型向胎儿型的转变从而**镰刀型贫血病。
(2)用于揭示**发生的机制。
与其他技术结合使用，细胞融合是一种揭示**机理的有效方法。例如，细胞融合与**荧光，生化分析，电镜技术相结合，LattanziG等对肌肉萎缩症发生的机理进行了研究cH]。
(3)用于膜蛋白动力学研究。
细胞融合技术与显微镜技术结合使用被用来研究膜蛋白动力学以及这些膜蛋白之间的关系，P6terNagy等的研究发现大型膜蛋白群之间(主要组织相容性复合物majorhistocompatibilitycomplex，MHC，包括MHC I和MHClI)发生蛋白质交换，并且群内蛋白之间也发生蛋白移位，小蛋白群之间也存在着蛋白重排现象。
3． 植物细胞融合技术
植物细胞融合技术目前主要是作为扩大变异的手段，同时也正朝着将抗药性和胞质雄性不育等细胞质基因导人另一个体细胞的方向发展，有可能形成新的核质杂种。如果获得了有用性状的细胞系，在还不能形成植株时，就可以通过快速大量繁殖细胞加以利用。在生产应用研究方面，植物细胞融合在育种上有重要的应用价值，通过诱导不同种问、属问甚至不同科问原生质体的融合，可能打破有性杂交不亲和性的界限，广泛地组合各种基因型，从而有可能形成有性杂交方法所无法获得的新型杂种植株；另一方面又可将各种细胞器、DNA、质粒、病毒、**等外源遗传物质引入原生质体，从而有可能引起细胞遗传性的改变，为某些**植物的快速繁殖、植物的复壮等提供了可行的方法，应用于植物育种、种质保存、无性系的快速繁殖和有用物质生产等。植物细胞融合配合常规育种技术，可望选出优良材料，加之体细胞杂交来自双亲的遗传物质并非简单的堆积，而是发生了复杂的遗传重组，这正是改良作物所期望的。植物细胞融合的作用主要表现在以下方面：通过植物细胞融合培育抗病新材料；合成新的物种，转移细胞质基因。原生质体新培养体系的研究将会提高融合率。YamagishiH等[】设计了一种新的高效原生质体培养体系，增加了不对称杂交属内种间细胞融合率可以设想，细胞融合技术发展后，可以把人参和虫草的细胞融合，产生新的品种，并具备它们各自特有的
药效，这是非常有意义的事。
4． 微生物细胞融合技术
用于植物和微生物育种是细胞融合技术*基本的应用领域。对微生物而言，该技术主要用于改良微生物菌种特性、提高目的产物的产量、使菌种获得新的性状、合成新产物等。与基因工程技术相结合，使对遗传物质进一步修饰提供了各种各样的可能性。目前，微生物细胞融合的对象已扩展到酵母、霉菌、**、放线菌等多种微生物的种间以至属间，不断培育出用于各种领域的新菌种。自1979年匈牙利的Pesti首先利用微生物原生质体融合技术提高青霉素产量以来，开创了原生质体融合技术在实际工作中的应用。微生物细胞融合技术的一项突出应用是生物药品的生产，包括***、生物活性物质、疫苗等，它适用于**的诊断、预防及**等。另一方面的突出应用就是为发酵工业提供优良菌种，例如日本味之素公司应用细胞融合技术使产生氨基酸的短杆菌杂交，获得比原产量高3倍的赖氨酸产生菌和苏氨酸高产新菌株。酿酒酵母和糖化酵母的种间杂交，分离子后代中个别菌株具有糖化和发酵的双重能力。日本国税厅酿造试验所用该技术获得了优良的高性能谢利酵母来酿制西班牙谢利白葡萄酒获得了成功。在基础理论方面，研究外源DNA转化、质粒转移、基因定位、病毒传递以及核与核、核与质之间的关系等已取得重大进展。
欧盟生物实验室设备与维护集团（BiologicalLaboratoryEquipment, MaintenanceandServiceLtd.简称：BLS）,BLS公司是欧洲一家专业生产电融合设备的厂家，尤其在胚胎干细胞的电融合上面更具有全球****的技术。BLS细胞融合仪CF-150B和相关电极槽(GSS-250)专为哺乳动物胚胎分裂球电融合而设计，可在电解液或非电解液中运用。一个适当导向的短电脉冲施加在早期胚胎可以溶解细胞膜，从而完成细胞质和细胞核融合。此细胞融合仪的主要应用是产生小鼠四倍体胚胎产生和体细胞核转移克隆。
