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绿色荧光蛋白嵌合体小鼠的建立和鉴定

日期:2020-09-21 01:43
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摘要:

摘 要 为研究嵌合体动物中供体胚胎干细胞( ES) 在宿主胚胎发育中的走向和定位, 同时探讨绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因在转基因动物制作中的应用价值, 本研究将p EGFP2N1 基因导入小鼠ES2D3细胞系,得到稳定表达GFP的胚胎干细胞亚系ES2D32GFP , 通过对昆明小鼠的囊胚腔注射, 获得了4只表达绿色荧光蛋白的嵌合体小鼠。其中1 只存活至成年,3 只出生时死亡。荧光显像及组织PCR检测显示了绿色荧光蛋白在小鼠体内的嵌合情况。以绿色荧光为指标可实现活体水平的动态观察,本实验**观察到以GFP为指标所示的机体嵌合情况与根据毛色嵌合推测的机体嵌合情况存在很大差异, 以GFP 为嵌合指标更加**而准确;但不排除GFP对小鼠发育存在一定毒性的可能; 另外, 有结果显示供体ES 细胞在宿主体内除了大片补丁状嵌合外,还存在细胞散在嵌合的情况,后者提示了在组织中利用GFP 对ES细胞实施单细胞追踪和实时观察的可行性,为胚胎发育和**发生的相关研究提供了新的观察方法..
 
ES 细胞介导的转基因动物制作途径建立于1986 年( Robert son et al. , 1986 ; Gossleretal.1986) , 嵌合体动物的获得是实现ES 细胞途径的决定性步骤(Auerbach et al. , 2000),其中一个重要问题是嵌合状态的分析, 即如何将嵌合体中ES来源部分同宿主部分区别开来。*初用毛色作为嵌合指标,但此方法对内脏的嵌合无法分析(Hooper etal. , 1987 ; Nagyet al. , 1993) , 现在常用LacZ 报告基因法( Yvan and Philippe , 1990 ; Suemorietal. , 1990 ; Woodet al. , 1993) 和GPI 同功酶电泳法(Nagy et al. , 1993 ;Beddington andRobert son ,1989) 标记ES 细胞, 可以检测内脏的嵌合, 却需破坏机体致其死亡,无法对同一活体进行动态研究,而且检测技术要求高, 方法复杂。GFP 作为一种独特的报告蛋白,无需抗体、辅助因子、酶底物等其他成分的参与,在荧光显微镜的蓝光激发下, 发出绿色荧光(Chalfie et al. , 1994),其*大优点在于它在活细胞内的示踪作用。建立绿色荧光蛋白嵌合体小鼠,可以在荧光显微镜下透过皮肤见到高强度荧光,达到在活体水平上对内脏嵌合进行直接观察的目的, 克服了以往方法的缺点。英国和加拿大实验室(Zerncka2Goetz et al., 1997 ; Ha2diantonakis et al. , 1998) 将表达GFP的ES 细胞
与8 - 16 细胞期胚胎聚合, 得到绿色荧光蛋白嵌合体小鼠,但未对出生嵌合体小鼠的嵌合状态进行系统分析。国内在对ES细胞和嵌合体制作取得一定研究基础后(冼美薇等, 1996 ; 陈伟胜等,1999 ;**等, 2001 ; 马芸、陈系古,2002) , 近年来开始将GFP 基因引入ES 细胞( 杨桦、傅继良,2001 ;沈干等,2003) 。通过ES途径建立表达GFP 的嵌合体小鼠在国内尚未见报道。我们将p EGFP2N1 基因转入D3 小鼠ES细胞, 并进行ES细胞囊胚腔注射,得到ES 细胞介导的存活绿色荧光嵌合体小鼠, 以GFP 为报告蛋白对ES 细胞的嵌合情况进行观察,同时进行未转染GFP基因的ES2D3 细胞囊胚腔注射, 以此为对照, 探讨GFP基因在小鼠体内表达的安全性。

1  材料与方法

111  材料

11111  实验动物和细胞系 
ES2D3 细胞系, 昆明小鼠由中山大学实验动物中心提供; 小鼠胚胎呈纤维细胞(MEF) 取自孕1215 d 昆明小鼠胚胎。

11112  实验试剂
 
绿色荧光蛋白真核表达质粒p EGFP2N1 (N1 末端改进型荧光蛋白载体) 为Clontech公司产品;Lipofectin转染试剂盒购自GBICO 公司, Bam H Ⅰ限制性内切酶试剂盒(目录号MR0521)、RNaseA购自华美生物工程公司,DL15000Markers 试剂盒购自大连宝生物公司;DMEM 培养基和L IF购自GBICO公司胎牛血清购自杭州四季青公司; 胰酶、M16 、M2 培养液购自SIGMA 公司。

112  方法

11211  ES2D32GFP 细胞的建立和培养 采用脂质体介导法用质粒p EGFP2N1(N末端改进型荧光蛋白载体Clontech 公司) 转染ES2D3 细胞。将10 μl质粒p EGFP2N1、Lipofectin分别溶于100μl 80μl
无血清DMEM 培养基中, 混合后加入800μl 无血清DMEM 培养基混匀, 滴加至ES2D3 细胞上, 加入转染液后于37℃、5%CO2 培养箱内5 h 。弃转染液, 换ES 培养液继续培养(培养液为葡萄糖含量4 500 mg/ L 的DMEM 添加20%FBS、β2巯基乙醇011 mmol/ L 、L IF 1 000 IU/ ml、青霉素100IU/ ml 、链霉素100IU/ml) 。48 h 后消化接种至经MMC 处理过的MEF 上, 继续培养24 h 后, 用浓度为300μg/ ml G418的ES细胞培养液筛选抗性克隆, 倒置荧光显微镜下挑取荧光*强的克隆, 命名为ES2D32GFP 细胞, 进行扩增培养。

11212  ES2D32GFP 细胞未分化状态及多能性的鉴定 ①碱性磷酸酶检测 采用Gomoriα2萘基磷酸
法进行染色。②体内成瘤实验 将含有1 ×106 个ES 细胞悬液011 ml 接种于4 - 6周龄雄性裸小鼠腹股沟皮下,待肿物形成约5 周时处死裸鼠, 摘取肿物, 制作冰冻切片于荧光显微镜下观察,常规石蜡切片HE染色作为对照。③体外胚体形成实验 将ES 细胞消化成单细胞悬液, 加不含L IF的培养液在玻璃培养瓶内培养,每天摇晃培养瓶多次。

11213  囊胚的收集 注射用囊胚取自四周龄超排昆明母小鼠, 与同品系公鼠合笼, 见栓315 d (当日见栓为015d)时从**和输卵管中收集胚胎,移入上覆石蜡油的M 16 培养液滴内, 于37 ℃、5 % CO2 孵箱内培养。

11214  囊胚腔注射 ① 实验组 注射用细胞为ES2D3 细胞系转染GFP 基因后传代至7 - 15 代。
②对照组 注射用细胞为未转染GFP 基因的ES2D3 细胞系在本实验室传代至15 - 25 代。注射前3h更换新鲜培养液,胰酶消化后制成单细胞悬液备用。将适量ES 细胞悬液和囊胚期胚胎移入M2 注射液滴内, 在显微注射系统下,用持卵针固定囊胚,用注射针吸取ES 细胞, 从远离内细胞团的滋养层部位进针, 每个囊胚注射ES 细胞10 - 12 个。

11215  嵌合胚胎的发育 注射后囊胚腔消失, 置于培养液中于孵箱中培养1 - 3 h , 待囊胚腔恢复后, 移入见栓215d的假孕母鼠**中进行培育。

11216  荧光成像 将注射后胚胎、出生小鼠、置于倒置荧光显微镜载物台上进行荧光观察。对于出
生后即死亡的嵌合体小鼠, 取部分部位做冰冻切片, 切片厚度20 μm。使用共聚集荧光显微镜观察, 激发波长488 nm,发射波长507 nm。

11217  PCR 检测 存活小鼠死亡后, 在其各脏器中随机部分取材, 提取基因组DNA , 通过PCR 检测GFP基因。以质粒pEGFP2N1 为模版, 设计引物P1 , 5′AAG TTA ACA TGG TGA GCA AGGGCG AGG3′; P2 ,5′AAC CTC TAC AAA TGTGGT ATG GCT G 3′, 扩增基因片段大小约为840bp。反应条件为95 ℃45 s , 56 ℃ 45 s , 72 ℃ 1min , 28 个循环, PCR 产物以2%的琼脂糖电泳观察。

2  结 果

211  ES2D32GFP 细胞系的鉴定

ES2D32GFP 克隆在倒置光镜下呈岛屿状隆起,边缘整齐, 表面平滑, 结构致密,细胞间界限不清;荧光显微镜下可见克隆发出较强绿色荧光, 表面荧光强度均匀(图版Ⅰ: 1A , 1B) ,传代后荧光强度未见衰减;消化成单细胞悬液后, 细胞小、圆而亮, 几乎所有单个ES 细胞均发出绿色荧光(图版Ⅰ: 2A , 2B)。
ES2D32GFP 碱性磷酸酶染色阳性, 细胞克隆呈深黑色。成瘤实验中,畸胎瘤显示绿色荧光,肿瘤组织含有来源于三个胚层的多种细胞类型。胚体形成实验中, 3 - 5 d 细胞团开始分层, 形成简单类胚体,外层细胞大而松散,内层细胞小而紧密,6 - 12 d 分层增多, 出现囊胚腔, 成圆泡状, 荧光显微镜下见整个胚体发出绿色荧光,胚体贴壁培养后2 -3 d , 细胞团周边可自发分化为多种形态的细胞, 分化后胚胎仍有强荧光显示。

212  ES 细胞囊胚腔注射和嵌合体小鼠的建立


ES 细胞囊胚腔注射(图版Ⅰ: 3A , 3B) , 后于荧光显微镜下观察,实验组所有胚胎均有细胞显示绿色荧光,对照组未见荧光。注射后囊胚腔消失,培养1 - 3 h 后部分胚胎囊胚腔恢复,移植入假母**中继续发育, 孕期18 d左右。对囊胚存活率和产仔率用χ2 检验做统计学分析, 结果显示, 转染GFP基因组囊胚存活率和产仔率明显低于未转染GFP 基因组,两者差异具有统计学意义( P1 < 0101 , P2 <0101) 。

213  嵌合体小鼠的荧光显像

将刚出生小鼠置于荧光显微镜下观察, 以未经操作的同龄昆明小鼠作为对照。镜下可见实验组中有4 只小鼠发出绿色荧光, 1 只存活,3只出生时死亡。4 只小鼠均在头颈部、胸部、腹部、肢体部位发出绿色荧光,绿色部分呈块状或线条状嵌合在未发光的黑暗部位中,对照组未见荧光(图版Ⅰ:4A , 4B) 。

214  对存活嵌合体小鼠的观察

存活的绿色荧光蛋白嵌合体小鼠在荧光镜下发出明亮的绿色荧光,荧光部位分布在其头部、胸部、腹部和尾尖。当此小鼠长毛后,在其头顶部呈现一块不规则形黑**斑, 胡须中有2 根为黑色,呈现出ES细胞来源的D3 小鼠毛色的嵌合,头顶部的毛色嵌合位置与荧光显微镜下所见之绿色部位吻合(图版Ⅰ: ** , 5B)。此小鼠生长发育迟缓,三周龄时,体重、生长仅为同龄普通昆明小鼠的一半, 且前肢短小, 步态摇摆, 尾部两处扭曲, 根部增粗,显示有畸形发育。8 周龄时,与成年普通明母鼠1∶2 合笼, 但未见生育迹象。因被毛的折光对荧光成像的干扰,小鼠长毛后头、胸、腹部的显像受到影响,但被毛较少的尾尖在荧光显微镜下依然可见强烈的绿色荧光。小鼠出生四个月后死亡, 对其进行解剖,取各脏器于荧光显微镜下观察,在脑、心、肺、肝、肠、肾、睾丸、肢体肌肉中均见绿色荧光部位的嵌合。
3  讨 论

本实验成功获得了绿色荧光蛋白嵌合体小鼠,以荧光为指标在活体水平上对内脏嵌合状态进行直接观察。

外源ES 细胞在宿主胚胎中以单细胞嵌合的方式提示我们, 在胚胎发育和**发生的研究中, 可以利用GFP对ES细胞实施单细胞追踪和实时观察, 研究其分化或病变情况。此外, 如果证实在生殖系的嵌合中也存在外源ES细胞单细胞嵌合的情况,则以往对生殖系嵌合的检查方法必须重新评估。值得指出的是, 对存活的嵌合体小鼠的观察发现,以GFP为指标所示的机体嵌合情况与根据毛色嵌合推测的机体嵌合情况存在很大差异。以往认为,从外观毛色的嵌合可以推断内脏的嵌合情况,两者之间存在正比关系,如果没有毛色的嵌合则一定没有内脏的嵌合(Hooper et al. ,1987) , 在我们的实验中, 小鼠毛色的嵌合仅见于头部,而荧光所示除了头部相应的嵌合以外,在胸、腹、尾尖多处部位也存在来源于供体ES 细胞的组织的嵌合,这提示了单纯以毛色的嵌合来判断机体的嵌合状态存在一定的局限性,以GFP 为指标则更加**而准确.(摘自动物学报)

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