不经显微操作进行体细胞克隆(徒手克隆)

本文描述了一种手工平分无透明带卵母细胞的改进核移植方法，Hoechst染色挑选胞质体，以培养的原代颗粒细胞为体细胞与2个胞质体进行2次细胞融合。检测微滴、穴中穴(WOW)和微管(GO)3个系统培养的无透明带胚胎，胚泡率分别为0，18和36 ，方法简单、快速、经济，有可能取代现有的体细胞核移植技术而大量应用。

影响反刍动物体细胞核移植广泛应用的主要技术障碍是：① 体外法效率低；②妊娠和产犊率低，出生后死亡及异常发育率高；③体外法所需实验室设备费用高，技术难度大。显微操作被认为是该工作中不可缺少的。此外，工具制作设备如研磨机，微锻炉等的使用均需较高技术水平。这些要求相当程
度地限制了核移植技术的简化及广泛应用。

Peura等(1998)建立了一种不经显微操作进行牛胚胎细胞克隆的方法，用20~60细胞阶段的卵裂球胚胎为供体。

用1016个卵母细胞进行了7次重复核移植试验，其主要步骤的平均效率和大概需要的时间见表1。弃去第一极体不明显的卵母细胞(占28%)。这些丢弃的细胞不能用于核移植，因此，没有将其列入效率统计。在该过程完成后5rain观察到丢弃细胞在均分期间发生分解。最终胞质体选择的准确度接近100％，尽管有9%的差别，这主要是因技术失误及细胞估计数和实际获得细胞数量间的差异而引起。细胞的丢弃几乎都是在融合时因分解或技术失误而引起。融合失败(融合后15~20rain分离细胞对)的细胞对异常且在重复融合中通常被消除。

每个试验平均用了105个卵母细胞并形成35个胞质体一胞质体一颗粒细胞3联体。每次试验时间不超过3h。分别在3个培养系统中培养，其胚胎发育率见表2。除培养在微滴与WOW培养系统中胚胎卵裂率(2个或2个以上细胞)外，其余数值都差异显著。一般来说，微滴中培养的胚胎没有超过8~16细胞阶段；仅在WOW或GO系统中能发育到致密期。通常在胚胎重组后第6 d开始形成胚泡，到第7d结束。因滋养层细胞将30％左右的胚胎粘在培养皿表面，因此在wOw系统中移去胚泡有些困难。但GO系统可避免这些问题。

不需显微操作体细胞核移植的利益和前景远大。当前的成果包括降低装备费用，简化预备工作及实验技术要求低。任何做过胚胎方面试验和口吸管方面工作的人都能很快掌握。尽管用卵母细胞试验的直接工作没有显著减少，但降低了这些工作的技术难度。此外，与早期的技术相比，预备工作如制作工具可以省略。然而，应该注意到产生三倍体需要较多的卵母细胞。无透明带的胚胎可能有利于嵌合体的制作，克隆方法的简化也将有利于核移植的自动化。在卵母细胞成熟期间，用于建立该方法的供
体细胞是贴壁的原代培养的颗粒细胞，这些细胞并不是都很适合做供体。随着方法的进一步改进，可能能用不同器官组织的传代细胞和血清饥饿培养的细胞。

总之，这种新颖、简单的体细胞核移植方法的出现，将大大降低目前核移植对昂贵且操作技术难度大的显微操作仪的依赖。本文报道的初步试验结果表明，该方法在体细胞克隆技术方面的发展具有相当大的潜力，满足农业领域内克隆技术广泛应用的需要。上述方法的可行性需要通过这些移植胚胎妊娠(目前正在获取)和产出健康后代的数据来证实。)摘自《国外畜牧科技》

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