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自发活动试验方法学研究进展

日期:2024-03-29 08:51
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摘要:

 自发活动试验是一个**神经系统**药理学评价及神经科学学科研究的常用方法,自发活动试验已经发展成一类可对多种动物观察多项自发活动分类行为指标,并为包括**神经系统**药理学研究在内的多种药理学研究目的提供参数的重要方法。近年来研制的新试验装置和发展的新方法具有较多优点,本文简要介绍近年来鼠、猪与猴自发活动试验方法学研究若干进展。

关键词 自发活动;开场试验;**药理学;药理学方法

自发活动行为测定是一些神经科学学科研究动物的安宁、神经行为遗传学及脑功能的重要参数,作为**神经系统临床前观察**行为作用和**药理学评价的始初筛选一般包括行为和活动测定。活动行为监测亦是观察生存健康的主要生理指标及研究宾主共栖生物的影响和环境因子的一种手段。因此,活动行为监测已经渗透到大多数啮鼠类动物广泛范围的各项研究,并已扩大到对非人灵长类动物等的研究,无论作为主要关注点还是附加方法,已涉及研究灵长类的时间生物学、营养学、毒理学范畴。各种动物有其自身的自发活动类型,因而测量装置应按动物特点设计。监测动物行为活动的方法有红外线光束、超声波、视频分析、电压金属板、运动传感器、机械振动传感测定、机械装置、植入遥感勘测传送装置等定量活动行为方法。抖笼法、抖笼滴水法、转轮法、斜笼法、运动计量法等以往的经典方法现已不常用。近年来研发的一批新装置和发展了一批新方法具有较多优点,本文简要介绍近年来自发活动试验方法学研究若干进展。

1 .小鼠自发活动试验

小鼠自发活动试验是应用*广的自发活动行为测定方法,其中多数用红外线光束法测定小鼠的自发活动总数,或用开场法人工或自动记录穿越格数、后腿站立次数、理毛次数、大便粒数、竖起或修饰次数(两前肢离地1cm以上的次数)、竖起或修饰时间(两前肢离地1cm以上的时间),但多数方法忽略呼吸、头与尾动作及颤动等小的移动。近年采用计算机视频跟踪系统能监测垂直与水平移动包括走动、
跳动和头部活动。

1.1 VidiomexV图象分析法

该系统测定开放场区的小鼠自发活动,给药后将小鼠单只放入垫有黑色橡胶板的开放场(35 cm×30 cm×22cm),适应环境10min,视频图象显示和图象分析仪均由电脑操作调控完成。图象分析系统自动显示和记录自发活动10min,测定参数包括走动距离、行走时间、静止时间和平均速度。作者用该法研究按Roth改良法给予15种不同处理组成的非预知性紧张性刺激复制的慢性应激小鼠与正常小鼠的自发活动,发现两组参数无显著差异。阳性对照药抗抑郁药地昔帕明l5II1g·kg能使应激小鼠的走动距离、行走时间和平均速度缩短,而静止时间延长。提示地昔帕明对应激动物有**作用,而巴戟天低聚糖处理小鼠的自发活动无显著变化,提示该药无兴奋或**作用。

1.2 啮鼠试验笼法

每个试验笼(40 cm×25 cm×15 em)放于12 em厚墙内的隔音木箱中,低高二个红外光束探头置于离地2、8cm处,地面垫1cm厚锯屑。
测量参数有:
① 走动,由低位探头测量小鼠在试验笼内的水平位走动;
②站起:由高位探头记录站起次数与站起所需时间的比例;
③活动总数:连续的接触试验笼的次数,即传感器接受动物所致试验笼的各种振动如走动、站起及摇动、震动、抓搔、修饰。测量时间为3个连续的20min。每鼠仅测1次活动参数。
用该法研究出生后10~12 d小鼠,开始给铁剂7.5 mg·kg~,61d后同时加用安定药氯氮平1或5mg·kg一,或安定药氟**醇1 mg·kg一,连续3周,末次药后24 h内测定自发活动,每只记录60min,然后注射阿朴**1mg·kg 再记录60 min。结果显示:出生后给铁剂可减少头2个20分的活动,而末20min显示活动增加。氯氮平5 lTlg·kg亚慢性给药,可削弱或完全消除出生后给铁所致头2个20min活动减少,削减给铁致末20min走动和活动总数增高,而对站起则无作用。氟**醇亚慢性给药对出生后不加铁者可增加头20min的走动和第2个20min的站起数。氟**醇亚慢性给药可消除出生后给铁组头2个20min的活动减少,也消除出生后铁所致末20min的活动增加,作用大于高剂量氯氮平。出生后加铁组给阿朴**后可增加走动和站起,而不增加活动总数。氯氮平1、5mg·kg亚慢性给药降低出生后加铁引起的走动增加,氯氮平5lTlg·kg进一步升高出生后给铁引起的站起增加。氯氮平和氟**醇亚慢性给药再给阿朴**可增加出生后赋形剂处理小鼠的走动,而氯氮平则增加站起数。该文这种给药后分时间段测定自发活动数和添加工具药的方法,有益于分析**影响自发活动的作用特点]。

2 .大鼠自发活动试验

2.1 开场试验

开场环境试验所伴有的温和紧张性刺激对动物是在一种新奇背景中的自发活动行为评价。动物在开场环境的活动是一种综合行为,包含对新环境的恐惧、高度激励和不断地探查。因此,可因逃跑反应而增加活动或呆住反应而减少活动,其中包含恐惧或焦虑因素,由于动物情绪状态的即时调节及其自体修饰、排便和排尿等行为和生理学反应而维持平衡。Weiss等_5报告了大鼠隔离饲养对开场试验自发活动的影响。位于实验室内的开放场由暗灰色塑料制成的4个正方形(76.5cm×76.5cm×49cm)区域组成,12勒克司弱光照明。视频照相机固定于4个区域的上方并传输到监控器和视频跟踪运动分析系统,记录大鼠在整个场区的活动行为作为总行走距离(cm),此外,在开场区设定一个虚拟的场区中心,大鼠在该区内的活动用作评价冒险行为。大鼠在试验场内适应60min后称体重,逐一放入开放场区中央进行试验,在60min的试验期内动物分组平均地进行。雄雌分别隔天进行活动计数10min,并分析试验期间动物粪便存积数。大鼠分两组,一组从21天龄起断乳后每笼1鼠隔离饲养,另组每笼3~4鼠群居饲养。结果显示,两组动物能适应开放场环境,雌鼠的移动距离(1610.1±154.7cm)多于雄鼠(999.7±109.1cm),但1 h内每10min测得的分段移动距离两组均逐步减少。如同在整个场区的活动一样两组动物在中心区的活动也显著地逐步减少,亦以雌鼠(184.7±33.7cm)高于雄鼠(59.2±12.3cm)。群居或隔离饲养不影响大鼠的自主活动。性别和群居隔离饲养对大鼠在整个场区或中央区内的移动距离均无相互作用。雌雄在开放场环境的排便量相似,群居隔离饲养及性别与群居隔离饲养间相互作用对排便无影响。

2.2 改良开场试验

该试验可结合观察对刺激物的注意力,装置的闭路视频相机置于方形白色室壁开放场箱(60 cm×60 em×45cm)上方50cm处,所有信号由视频跟踪系统分析并收集于电脑,试验时红光照明以增强物体与背景的对比并减少动物的阴影。占场区1/9的中心区由电脑分析器单独监控。试验开始前将4cm×4cm×2cm固体泡沫塑料块作为刺激物用螺丝固定放于中心区的中心。大鼠不必离室壁移动很远而容易地穿越中心区,这种设计的基本原理是创造一个环境使大鼠有低而可靠的可能性进入中心区而不管存在目标与否。为确证进入中心区与对刺激物的注意力有关,将动物头部用记号笔涂黑,使相机仅跟踪大鼠身体的该特征。10min试验期间每2.5min由电脑收集资料一次,以评价参数的动态变化。行为测量包括总移动距离、进入中心区的次数、持续在中心区的时间、进入中心区平均所需时间(s/进入)。该研究用开放场试验延伸分析动物对刺激目标的反应,而不引起活动增高的干扰,提供了一个动物对外界特殊刺激反应的行为指标,动物在试验期间即使重复应用相同的刺激物亦不降低对目标的反应,表明新奇不是引起探究反应的重要因素。调节开放场大小、放刺激物区域的大小与位置、刺激物的大小与成分以及试验期限能改变并扩充行为测量的内涵。如放置一个有气味的目标食物,然后除去食物,量化动物对食物刺激目标的行为反应,可用在中心区的停留时间以评价食物刺激的不同功效和评价厌食药的影响。同样,与性别相关的有气味刺激物也能用作评价**和药理学变量对性别相关刺激反应的影响。表明该方法对种种行为背景潜在的适用性,结合定量跟踪动物对特殊刺激目标的自发行为反应是行为神经科学一种有适用性的方法学。

2.3 计算机图像法评价自发活动 

啮齿动物活动图像自动识别装置(the rodent activity patternidentifi.cationdevice,RAPID)由观察环境、图像获取硬件和软件、图像分析和分类程序、资料分析程序等部件组成。观察箱为一底长52.5cmX高23.5cm的梯形树脂玻璃箱,分成两个等大的小室,室间壁上有6个直径1.2cm的小孑L,以使同步试验的对照和处理大鼠彼此看见并闻到气味,2个视频探头分别置于观察箱上方与侧面约1ITI处,可从2个方向观察大鼠的任何复杂活动。观察室白光照明,其大小的限制取决于视频照相机的像素,256X256像素的分辨率将适合于评价大致的活动行为,如增加到512×512像素,则对小鼠或大鼠整体可仔细分辨,如足与尾巴的活动亦不会遗漏。该RAPID系统规定的动作分类尽可能接近于明确的行为动作、状态、姿势、面部表情、抗议和动作趋势。包括5个主要身体姿势和8种修饰动作,两组13种动作相互关联而又独立,13个“单元动作”的双元结合形成27个不同的组合动作。5个主要身体姿势之一和8种修饰动作结合被定为一个组合动作类别,体位姿势伴有修饰动作时的组合动作呈配对发生。

表1 RAPID行为动作分类法的行为动作操作说明

主要身体姿势                     说明
站立                   大鼠四肢着地,身体不移动坐身体前半部抬起,身体前部和后部几乎成直角,身体后部着地
站起                  用后腿站起,身体趋于垂直,前部抬起
行走                  大鼠四肢着地走动
躺下                   身体腹部着地,不移动(至少需要5个画面)

修饰类动作

空白                     修饰不能识别
修饰                   嘴和足底触及身体
头转动                 头水平移动超过l5o
观望                   头向上但不针对一个目标,身体不移动
闻                        鼻子观测笼壁的一个孑L
嗅                      鼻子对着一个目标:地面或墙壁,身体不移动
转动                   头和身体水平移动超过20~
洗脸                  前蹄在头部挪动

通过分析个体间的可变性、对照值的重现性和受试物处理效应的稳定性考察实验装置的可靠性,发现RAPID系统行为动作的分类和3个经训练的人工观察者的分类相比,统计两者的Kappa值有高度一致性。人工观察和RAPID分类的修饰活动如嗅和闻彼此间亦有很好一性。评价2个独立实验室34只对照大鼠的变异系数,虽种系相同但并非无病原体,体重为2~3周龄,显示主要身体姿势动作的出现率大多数在25%~35%的范围内。将D.***1mg·kg处理大鼠的反应重现性与文献值比较,3名独立测量者的资料有明显一致性和重性,动物活动数、总活动时间和动作的时间分布和时间次序有高度相关性。该装置采用自动控制可降低偏见和减少误差,消除观察者的可变性,使手续程序轻松快捷,且可长久记录观察资料。由于近来硬件成本显著降低,且系统能观察大量动物,同时从几个视频记录器的终端得到资料,如设计15min同时观察2只大鼠,3个终端每小时观察6只大鼠,8h能观察72对,并能保存和分析所有资料,因此十分经济和高效 。

2.4 探测身体辐射热法试验 

Supermex系统用传感器探测动物身体辐射热来测量活动行为,传感器置于透明两烯酸鼠笼上方,两侧有一对红外热电探测器即站起传感器以测量动物站起的辐射热,该系统可发现一个直径6m和上方视野110。的圆锥形区域内温度高于背景5℃的任何目标,每个传感器探头能监测笼内多个区域动物在X、Y、Z轴的移动活动,适用于啮齿类小动物或小型长尾猴到大动物犬、猴和猪等动物,操作非常简便,灵敏度不需调节,传感器可以固定置于鼠笼上方的天花板,一个Super.mex能任意选择分析80个接口记录的数据。一名操作者能同时监控5只大鼠,自动汇总记录15min所得计数。用该系统测试发现促甲状腺素释放**和垂体腺苷酸环化酶活化多肽脑室内给药能剂量依赖地显著增加自发活动,促甲状腺素释放**200或4OOnmol产生的活动总计数5000次,为对照的250% ,垂体腺苷酸环化酶活化多肽1 mnol是对照的300% ,2mnol的总计数9 000次为对照的750%,而2nmol血管活性肠肽改变自发活动计数不显著。站起行为因**数明显低于自发活动故有更大的差异性,上述肽类所致的站起行为改变类型类似于自发活动变化的类型。促甲状腺素释放**和垂体腺苷酸环化酶活化多肽能剂量依赖地显著增加活动数,促甲状腺素释放**4OOnmol的站起数是对照的261%。垂体腺苷酸环化酶活化多肽1nmol增加站起数为对照的179% ,2nmol增加数为对照的400%,血管活性肠肽2nmol不影响站起数。作者认为刺激自发活动可能是由于激活多巴胺能系统,而刺激站起行为可能是由于激活去甲。肾上腺素能系统。因此,自发活动行为是观察**神经兴奋剂对儿茶酚胺能系统效应的一个好指标。

3 .小型猪数字视频跟踪系统测定自发活动

3.1 测定方法

连接数字视频记录器的记录猪自发活动的单色录像机,能监控整个场区(2m×3.15m)四角和每侧墙壁的中央以获取参数。7头18月龄雌性小型猪于进入研究前适应环境6个月,用D.***处理5次以使动物有相似的兴奋程度,末次给药在6个月前完成。试验开始前1周作3个30min的场区环境适应,测试10:O0~15:O0间的自发活动。每个d3做动物试验,先给赋形剂0.9%NaCl 0.2ml,随后以0.05、0.1、0.3mg·kg。。的递增剂量3次im盐酸阿朴**。注射后立即引入场内,静置1h,然后视频记录自发活动60min。结果表明该法有很好的可重复性,试验对每头猪跟踪10rain,7头猪跟踪两次的平均移动距离是29.6±9.6m,平均误差是0.10±0.02 m,可重复性系数0.6%,表明该方法有高的可重复性。

3.2 **性评价
 
为了评价基础干扰水平对**性的影响,将一只大约与猪相同大小和颜色(浅米色)的箱子(30cm×47em)作为一个固定目标放在开放场并“跟踪”10rain,用计算机从该箱记录的移动距离估计计算方法的**性,结果显示对该目标记录的误差仅一个像素,估计移动距离为2m。试验10min内对照的平均移动距离为42 4-17 m,能增加猪活动的阿朴**0.05 mg·kg作阳性对照为157±46m,误差大小与猪的总移动距离有关,约相当于移动距离预计误差的1% ~5% ,表明该方法有很高的**性。

3.3 方法学评价 

用转盘法估计对移动目标跟踪过程的**性,在距平均转速0.02 m·s 的黑色圆盘(直径34 cm)中心14cm处放一15lllln的白点,用跟踪软件估计的距离与白点移动的实际距离比较,白点准确移动二轮的计算值表示实际距离的百分比。结果表明,跟踪转盘上的移动白点的轨迹与跟踪系统所记录的实际轨道有很好的一致性。该点移动距离的实际计算值是176cm,而跟踪软件估计的移动距离是192cm,,跟踪系统高估移动距离9%。这种偏差主要是由于偏离标准的像素大小。跟踪系统识别该点是离转盘中心的距离不是14cm而是15.2cm,这相当于移动距离191cm,非常接近于跟踪运算得到的估计移动距离(192em),因此跟踪软件在估计移动距离时的偏差主要来自镜头扭曲,引起像素大小偏离标准所致。该方法通过增强动物和背景间的对比,以提高跟踪动物的**性,并克服了手工记录容易疲劳、漏记及带主观性等缺点。并证明猪尾巴摆动不影响移动距离测量的**性。在可控条件下未发现猪在开放场的中心区与周边区有任何区域空间偏爱,表明健康猪探测一个熟悉的区域无空间偏爱。而大鼠则不同于猪,有沿墙壁行走维持鼻毛与墙壁接触的不对称活动行为。

4 .小型长尾猴袖珍型活动挂表法模型

用于电脑遥控监测饲养条件下猴行为活动的袖珍型活动挂表为带有32kb内存包有圆柱形外套的压电加速计,猴戴挂合适的活动挂表项圈后能很好耐受,约5min后便不再理睬。该装置可以综合各个方向动作的强度、数量和持续时间,能测出大于0.5g作用力的活动。实验前24h将该装置挂于动物的颈项,每天定时测定15min,连续14d。试验分配对组8只猴(雄性切除输精管)饲养于4只笼内与群居组8只单一性别猴饲养于有管道相连的二只笼内,地面上方1m处有400勒克斯照明,12h的明暗周期。该法的显著优点是可以实时非侵害性地监测群聚在单个测试区域内的多只动物的自发活动,并便利地以*小干扰监测动物在居笼内的一种关键行为指标,而不用改变动物生活环境。这种在居笼内的行为和生理学监测,因为保持动物的平静,而具有科学的正确性和实用性¨。。。

5 .结语

自发活动方法学研究的新进展表明,自发活动试验已经发展成一类可对多种动物观察多项自发活动分类行为指标,并为包括**神经系统**药理学研究在内的多种药理学研究目的提供参数的重要方法。多种多样的自动化视频跟踪实验仪器设备与**定量的测量指标已取代肉眼目测、手工记录、装置简易与观察指标不多的传统方法。上述新近发展的自发活动试验方法给我们带来许多值得重视的启示:实验环境应适合动物习性,活动室所用建筑材料与色泽、活动区大小、环境隔音、光照强度、对环境的性别差异、观察持续时间与间隔选择等对不同的动物均应有不同的要求,否则可能会影响动物本能的自发活动的真实性。不同动物应观察其自身特有的自发活动行为,如小鼠自发活动的方式有走动、前肢上举、抓搔、洗脸、舐足、嗅闻、咬等,大鼠、猪、猴亦均有自身的自发活动特点及自发活动昼夜时辰与日间分布规律,因此应设计不同的观察指标在不同的时间作观察,并应尽可能在动物处于生理状况下取得不受人为干扰的真实原始数据。分类测定自发活动行为的各个单元动作,可区分**作用的特点。分析**对自发活动试验中走动、站起等不同指标的影响可以探讨**作用的机理,有作者认为刺激自发活动总数可能是由于激活多巴胺能系统,而刺激站起行为可能是由于激活去甲肾上腺素能系统。因此,自发活动行为是观察**神经兴奋剂对儿茶酚胺能系统效应的一个好指标。
根据**特点在自发活动试验中添加目标刺激物、气味或性别特异性等目的刺激物,在观察自发活动的同时观察动物对这些刺激物的注意力,或许可以发现**新的药理作用。药理实验方法学研究是药理学的重要组成,研究方法的改进与**将会推动药理学科的发展,因此也应该是药理学者研究的重要内容,从本文简述的自发活动试验方法学研究若干进展,提示被认为十分简单的自发活动试验方法也是大有研究价值的,药理实验方法学研究应该成为药理学工作者共同关注的药理学分枝学科。
                               
摘自<中国临床药理学与**学>

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