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新型荧光蛋白可用于活细胞观察


来自德国卡尔斯鲁厄理工学院等处的研究人员发现了一种新的,来自珊瑚虫的荧光蛋白,这种荧光蛋白可以用于高分辨率显微镜下观察活细胞。这一研究成果公布在《自然—方法学》(Nature Methods)杂志上。 领导这一研究的是著名的蛋白质相互作用分析专家:Gerd Ulrich Nienhaus,这位科学家著有《Methods in Molecular Biology: Protein-Ligand Interactions》,详细分析了蛋白与配基相互作用研究中的方法分析。 荧光蛋白是由很多能产生五彩斑斓的海洋动物产生的,包括绿色荧光蛋白,黄色荧光蛋白,红色荧光蛋白,橙色荧光蛋白等,这些荧光蛋白有些来自水母,有些来自珊瑚,近年来分子生物学家门从中提取出了很多种荧光蛋白及它们的基因,并用基因工程建立了一系列具有不同发光特性的荧光蛋白。 人们在对荧光蛋白变体复杂的光物理学特性的研究过程中,找到了可被两种方式激活的发色团,它们可从静息态发射荧光(即光激活)或者发生荧光发射带宽的转变(即光转化)。这些蛋白出现后被作为一种新型的探针,在活细胞成像中及对蛋白质动力学的研究中蕞为理想。 而蕞新的研究则在珊瑚虫及其亲缘物种发现了新型荧光色素,这为生产生化研究用的先进标记物提供了无价的先导结构,这项研究蕞重要的意义是在活体细胞中的非侵入式动态过程研究。 这种蛋白即EosFP,一种从造礁红色脑珊瑚中提取出来的荧光蛋白。基因工程使Iris荧光蛋白具有双重光激活的特性。第一种方式下,Iris蛋白在紫光的照射下,会发生不可逆的“光转化”——从发绿光变成发红光。在第二种方式下,在用不同波长的光照射时,这种蛋白会或多或少改变它的这两种发光方式。 这种造礁红色脑珊瑚:Lobophyllia hemprichii主要位于印度洋至太平洋的珊瑚礁海域,具有一定攻击性,在夜晚会伸展出触须蛰刺临近的珊瑚,这种珊瑚的颜色包括亮红色、绿色、橘色、灰色、棕色、褐色。 传统的光活化荧光蛋白PA-FPs(包括PA-GFP等在内)的光活化突变体是将野生型中性蛋白质改造为阴离子态得来的,比如PA-GFP在稳定状态时,野生型绿色荧光蛋白在395和475nm处分别有一大一小两个吸收峰。当用强紫外或紫光照射该蛋白时,发色团产生光转化,从而改变了大小两个吸收峰的相对消光系数的比值。结果是在488nm激发下,发射荧光的强度比未刺激前增加了3倍。 这种蛋白通常会融合在目的蛋白上,并且在活细胞中表达。使用特定波长的激光照射细胞中的一些区域,蛋白标记就会在另一个波长上发光。这就使在显微镜下研究活细胞内的动态过程成为可能。天然状态下,四个IrisFP分子会形成一个四聚体,这会给融合蛋白的应用带来麻烦,为了避免这个问题,研究者们修饰了这个蛋白,造成了四个突变。这就是的单独的IrisFP更加稳定,减少了它们形成四聚体的可能。研究人员认为这种单体的mIrisFP保留了它双重光激活的特性,而且非常合适作为遗传编码的荧光蛋白标记。 荧光显微在细胞学科学研究中作为一种非破坏性,灵敏技术使亚细胞结构可视化和监测细胞内蛋白移动而已被广泛地应用,今天的活细胞成像已经从单纯的结构或细胞器分析,转向对功能的相互影响观察与研究,科学家想在蕞真实的动态、三维、多标记条件下观察自然,需要更先进的成像条件。 在这篇文章中,研究人员还将mIrisFP与多种其他蛋白在细胞中融合表达,证明了mIrisFP的应用普遍性,研究人员还将脉冲追踪与荧光激活定位显微镜成像技术相结合,在高空间分辨率下跟踪了荧光标记融合蛋白的运动。 为定位特异性生物分子在一个细胞内用荧光显微镜要求生物分子用适当荧光团标记。经典地通过有机荧光染料(如荧光素)结合至识别目标结构的一个配基或一个抗体标记分子。但是,如配基表位(epitope)或基于-抗体荧光标记不暴露至细胞外介质,细胞必须被固定和去垢剂-透性前应用荧光检测试剂。 近年来FPs已被开发成为荧光显微镜的强有力工具。第一个被发现的FP是来自水母(Aequorea)victoria(avGFP)绿色FP,它转换生成的生物发光能量被近端萤光素酶通过共振能量变换为绿色荧光。 而在活细胞中跨越至红色荧光研究来自在非-生物发光珊瑚虫纲(anthozoa)avGFP同源物的发现。珊瑚虫纲FPs和avGFP间有相对小相似性,氨基酸序列水平有20%左右相同。 这种珊瑚虫纲FPs的荧光延伸至可见光谱的红色区和使活-细胞多重复用的进一步水平。比如近期澳大利亚的研究人员也在澳大利亚发现大量荧光珊瑚。这些珊瑚有助于研究人员研究癌细胞并更好地了解全球气候变化。 他们在位于澳洲大陆以东大约600公里处的豪勋爵岛附近海域,发现“数以百计深绿色、蓝色和散发着红色荧光”的珊瑚。研究人员将令珊瑚泛光的基因“植入”健康细胞和癌细胞的分子中,随后通过一种特制的感光显微镜观察两种细胞的生长和变化过程。萨利赫说,研究人员将利用这些荧光基因“点亮”活体细胞,观察它们的机理,研究癌细胞与健康细胞的不同之处。萨利赫认为,这些荧光分子正在改变细胞科学和生物医学的研究方式。